菜单

脂质体纳米粒子:促进基因疗法从概念到临床


几乎任何疾病都可以通过沉默病理性基因、表达有益蛋白或编辑有缺陷的基因来治疗,所以基于RNA或DNA的基因药物具有显著的治疗潜力。然而,基于核酸聚合物的药物需要复杂的传递系统才可以将这些大分子传递到靶细胞的内部。
所以此类药物临床应用的最大障碍是在体内如何有效地将基因递送到靶组织细胞内即合适的药物递送系统是临床试验取得成功的最重要因素之一。
在克服基因传递障碍中AlnylamPharmaceuticals的给出的脂质纳米粒(LNP)方案中一项关键技术就是在LNP-siRNA系统中掺入了一种经过优化的可电离阳离子脂质(DLIN-MC3-DMA或MC3)。在LNP-siRNA系统中掺入MC3可带来高效的基因沉默效果,在小鼠模型中,在低剂量水平(5ug siRNA/小鼠 kg)下可有效地沉默小鼠肝脏中的基因。2017年9月AlnylamPharmaceuticals的Patisiran(一种载siRNA的LNP的制剂,用于治疗遗传性胸腺肽介导的淀粉样变)通过了临床三期试验,预计将于2018年获得FDA的上市批准。这一成就在很大程度上归功于离子化阳离子脂质的发展。
除了Patisiran,目前还有10种LNP递送小分子药物获得了监管批准。本文将回顾了LNP传递系统的研究进展,介绍了LNP潜在的应用,包括肝以外的组织基因沉默和基于mRNA或CRISPR的治疗方法。
1 基于核酸聚合物的基因治疗的障碍
在上世纪90年代,基因治疗早期研究方向侧重于通过传递DNA来诱导目标细胞表达特定的基因。但pDNA在小鼠全血(体外)中的半衰期仅为10 min,静脉注射后在体内的半衰期甚至更短,同时还有快速的肝积聚。所以核酸治疗的第一个主要障碍是血清核酸酶活性使得pDNA在血清中快速的消除。第二个障碍就是免疫刺激,尽管经过化学修饰的核酸可以部分规避这种免疫反应,但从生物来源纯化的pDNA,并非合成而来,不适合这种修饰。并且在生物纯化过程中也易受到原材料中热原(内毒素)的影响。但是,即使被经过大量修饰的核酸跨过了前两个障碍,它们仍然受到第三种障碍的影响——肾过滤(小于6nm的颗粒的高效过滤)。对寡核苷酸药动学的研究表明,50%以上的药物在尿液中排泄。这些研究表明未修饰的核酸聚合物作为治疗剂,由于其生物利用度差而应用受到限制。
为了克服这些障碍,已经有关于许多递送系统的探索。在本中,我们主要介绍脂质,最早是Felgner等人利用正电荷脂质 DOTMA在体外研究发现,正电荷脂质转染比磷酸钙和糖苷介导的转染效力强了5至100倍。这项研究开始了基于脂质的载体递送核酸的研究。
2  用于递送核酸的LNP的设计
LNP载运小分子药物的制剂技术已经相对成熟,它具有适宜的粒径(100nm直径或更小),高封装效率,制备工艺稳定、表面电荷低的特点(低表面电荷可以减少与血清蛋白的相互作用)。通过不同的载药策略和制备技术,LNP载药系统可以实现核酸聚合物的有效聚集(> 80%)和递送。阳离子脂质可以实现负电荷的聚合物的包封,而这类阳离子脂质研发,如下所述经历了相当长的过程。
2.1 阳离子脂质和“lipoplexes”
早期开发LNP系统的主要努力方向是利用中性(两性离子)脂类的被动式包封法,这种方法利用静电特性来实现包封。但有包封效率较差(<40%)、转染效力有限的缺点
“lipoplexes”是基于DOTMA的研发的复合物,将DOTMA与一种“辅助性脂”——二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)结合在一起,并与DNA在溶液中结合,从而获得更高的包封率、更高效的转染能力。但“Lipoplexes”粒径范围从亚微米尺度到几微米不等,存在热力学不稳定的问题。Lipoplexes类的代表 Lipofectamine®试剂,具有较强的体外转染效力。这些第一代Lipoplexes,粒径较大和正电荷性(由阳离子脂质传递,导致血浆迅速清除),还有溶血、免疫原性。和其他毒性的缺点限制了它在活体实验的研究。
2.2  阳离子脂质和LNPs
第一代载运遗传药物(pDNA) 的LNP制备方案是采用阳离子脂质通过洗涤-透析的技术制备。该方法是将pDNA与阳离子脂质(DODAC)同OGP等洗涤剂混合,然后在OGP溶液中加入含卵磷脂和PEG-脂的溶液。最后的混合物被透析36-48小时,去除洗涤剂并形成纳米颗粒。当阳离子脂质含量为6~8 mol%时,包封率为30%,进一步用DOPE代替卵磷脂时,包封率可以达到70%。这些颗粒被称为SPLP (stabilizedplasmid-lipid-particles),在低温透射电镜下呈单片状结构,粒径分布在70 nm左右。
SPLP具有体内长循环特性,在小鼠中t1/2为 7小时,而裸露的t1/2 小于DNA 10分钟。这使得2.5%的注射剂量在24小时内在远端肿瘤处积累,同时在肝脏和脾脏中水平非常低。重要的是,与Lipoplexes相比,SPLP的肝毒性明显降低,在30 mg DNA的剂量下Lipoplexes可使血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平增加100倍,而175 mg DNA的SPLP在血清中检测到ALT和AST的处在基线水平。然而,由于包封率低、效力有限以及洗涤剂透析制造技术是单一且不可扩展的原因,阻碍了SPLP方法的进一步前进。
2.3 可离子化的阳离子脂质和乙醇载荷
洗涤-透析制备过程虽然可以生产均匀的LNP,但制备效率低下。因此,乙醇荷载工艺可以与可电离的阳离子脂质结合使用。最初的方法是用乙醇溶解脂质,并将该溶液加入到pH4缓冲液中的反义寡核苷酸(Aso)水溶液中。然后将产生的粒子挤出,得到均相的粒子群为100 nm的LNP,然后透析去除溶剂,中和pH值。该工艺包封率可以达到80%。在下一代技术中,脂质体最初是通过挤压形成的,然后在酸性pH条件下,40%(v/v)乙醇浓度注入ASO。所得粒子对ASO和pDNA系统的包封率分别高达90%和70%。
最新一代乙醇荷载是使用Batzri和Korn乙醇注射法之后使用自发形成囊泡的过程。在这个过程中,脂质以适当的比例溶解在乙醇中,而pDNA溶解在酸性缓冲液中,溶液快速混合包封率可以达到60%,然后立即将得到的纳米粒子进一步用乙醇稀释后包封率达到了80~90%,实现有效的封装。
3 可离子化阳离子脂质LNPs用于siRNA的传递
乙醇荷载技术与DODAP等可离子化阳离子脂质联合制备的ASO-LNP具有较好的药动学特征,但对提高ASO基因沉默能力有限,但后来却发现递送siRNA到肝脏部位会收到更好的基因沉默效果。
3.1 可离子化阳离子脂质的设计及临床应用
采用可离子化阳离子脂质的最初原因是为了实现在低pH条件下对带负电聚合物的有效包封,并且在pH7.4时也显示出相对无电荷的表面。然而,经静脉给药的LNP-siRNA系统对肝细胞基因沉默研究发现选用的离子化阳离子脂质至关重要。在进一步的进行全面的脂质筛选过程中,一个重要的原则就是,可离子化阳离子脂质必须有合适的pKa,只有足够高的pKa的LNP在内涵体酸性pH值下,阳离子脂质就能与内源性内质阴离子脂质结合,形成促进膜溶解的非双层结构,从而从细胞内的释放,但过高的pKa使得LNP在生理pH值下具有高的表面正电荷,可以吸附血清蛋白,并迅速从循环中清除。
在小鼠因子F VII(FVII)肝基因沉默模型,对含有多种可电离阳离子脂质的LNPs进行评价,确定实现50%基因沉默(ED50)的有效剂量。DLIN-KC2-DMA(KC2)作为可离子化的阳离子脂质,与DLIDEMA相比具有改善的活性,而MC3-LNP的ED 50进一步降低且毒性无增加,具备了临床应用的可能。
所以Alnylam Pharmaceuticals的采用MC3构建LNP-siRNA——Patisiran,用以静默由TTR基因突变以治疗遗传性运甲状腺素蛋白(TTR)介导淀粉样变引起的致命疾病。研究发现这一突变对含MC3的LNP-siRNA引起的基因沉默极为敏感。在一期临床中在0.5 mg siRNA/kg时人体耐受极好,而二期临床实验中0.3 mg siRNA/kg就可以收到很好的基因沉默效果,在2017年9月三期临床试验也取得了极佳的成果,达到了主要终点和所有次要终点,随后向FDA提出上市申请,至此第一款RNAi类药物有望获得上市批准。
4 未来发展



LNP-siRNA系统在肝细胞中沉默TTR基因的成功打开了一扇沉默肝细胞中的基因的大门,例如用于降胆固醇治疗的PCSK9基因。(Kexin样前转化酶枯草杆菌蛋白酶家族的第9个成员)。
但未来其他的应用不仅仅局限于肝脏细胞,使用LNP系统可以沉默肝脏以外的组织中的基因,如沉默致癌基因,治疗诸如癌症的疾病。另一方面,LNP技术的延伸到递送mRNA为治疗性蛋白质的表达提供可能,可以治疗各种需要蛋白质替代的疾病。最后,扩展CRSPR-CAS在体内进行基因编辑的可以治疗许多遗传病。其中一些目前正在临床试验中进行评估。
4.1 肝外靶区LNP-siRNA的设计
递送小分子治疗药物的脂质体系统通常使用聚乙二醇脂质修饰来增加循环时间,从而改善肝外靶部位的转运能力。然而,将聚乙二醇脂质(如PEG-DSG)掺入LNP-siRNA系统尽管可以实现体内长循环,实现持久性肝外分布,但大大降低了转染能力,这就是还有待解决的 ‘PEG困境’。
一项LNP-siRNA(含有PEG-DSG 3-5 mol%,粒径30 nm,半衰期10-12 h),敲除前列腺癌的基本驱动因子雄激素受体(AR)研究中发现。实现明显基因沉默所需的LNP-siRNA剂量为30 mg/kg,但是达到肝细胞ED 50的6000倍。为了提高效能,我们加入了前列腺特异性膜抗原的靶向配体,从而提高了基因沉默的能力,但不能达到临床潜力所需的数量级改进。还不值得临床开发。
中枢神经系统中LNP-siRNA转运与肝细胞中转运的原理相同(ApoE受体),然而,LNP-siRNA系统无法穿透血脑屏障,需要通过脑室内给药实现注射部位周围的沉默。一项关于LNP-siRNA介导的基因敲除实验中,实现了对SLC26A11的抑制,显著减轻了神经元肿胀。这些研究证实LNP-siRNA具有靶标识别的潜力,以及通过鞘内、室间或鞘内途径直接给药的治疗严重疾病的应用潜力
4.2 用于基因表达和编辑的LNP设计
随着将siRNA包裹到LNP中的乙醇荷载技术的发展,这种方法也可以用来封装mRNA、pDNA和其他带负电荷的大分子。这带来了基于mRNA的疗法的重大进展。
目前已经开展了大量优化载运mRNA的可离子化的阳离子脂质的的的研发,如静脉注射含有未经修饰的、编码促红细胞生成素(EPO)的序列工程mRNA-LNP,在猪和猴上实验都可以升高Epo水平,增加网织红细胞数,并提高红细胞压积。这说明了利用肝脏作为生物反应器表达治疗蛋白的可能性。
LNP-mRNA也显示出作为疫苗的潜在应用可能。Kranz等人研究表明LNP-mRNA在树突状细胞免疫治疗中,可以诱导DC细胞中抗原的表达。此外,还可以在黑色素瘤、结直肠癌和肺癌模型中诱导了强烈的抗肿瘤反应,还具有很高的安全性和耐受性。Yin等人利用LNP-CRISPR技术靶向小鼠的PCSK9基因治疗高胆固醇血症,在一次注射后可以将小鼠的胆固醇降低30~40%。
5 总结
可离子化的阳离子脂质在LNP-siRNA治疗中起到了的关键因素。MC3等脂质可以实现有效地包封siRNA,带来相对中性的LNP脂质纳米颗粒,而在循环中的相对中性的表面电荷,可以促进siRNA在胞吞之后从内质体逃逸到细胞质内。随着FDA可能在2018年的批准上市的Patisiran,这类沉默肝脏沉默致病基因的药物的收到很高临床期望。另外,含有可离子化的阳离子脂质的LNP也促进mRNA和CRISPR / Cas等其他基因治疗的快速发展。尽管,例如成本高企、内在的毒性和脱靶效应等困难依旧存在,但载遗传药物LNP现在可以实现肝细胞中几乎所有基因的敲除,表达或编辑,未来还有有望延伸至其他组织的应用,未来个性化基因疗法会有更重大突破。